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我国首例非洲猪瘟的确诊

时间:2018-08-07    点击: 次    来源:中国动物卫生与流行病学中心    作者:王清华等 - 小 + 大

摘要 :近日,辽宁省沈阳市一养猪户饲养的猪陆续发生不明原因死亡,病死猪剖检发现脾脏异常肿大,疑似非洲猪瘟场外配资感染。经国家外来动物疫病研究中心检测,确诊为非洲猪瘟场外配资核酸阳性,B646L/p72 基因序列417 个碱基与俄罗斯毒株 100% 匹配, 与俄罗斯和东欧目前流行的格鲁吉亚毒株(Georgia 2007)属于同一进化分支。这是我国发现的首例非洲猪瘟,疫情来源有待进一步调查。

非洲猪瘟(African swine fever,ASF)是由非洲猪瘟场外配资(African swine fever virus, ASFV)引起猪的一种急性、热性、高度接触性动物传染病,临床上以高热、网状内皮系统出血和高死亡率为特征,易感猪群的病死率高达 100%。鉴于该病的严重危害性,世界动物卫生组织(OIE)将其列为法定报告动物疫病,我国将其列为一类动物疫病。ASFV 不感染人,对人的健康不构成威胁。目前,针对 ASF 防控,尚无有效的商品化疫苗。

2018 年 8 月 1 日,国家外来动物疫病研究中心接到辽宁省沈阳市沈北区发现 ASF 临床可疑病例的报告(图 1)。截至 8 月 1 日,发病猪场累计死亡 47 头,对刚病死的 2 头猪剖检发现:脾脏极度肿大,严重梗死,质脆易碎,其中一头猪脾肿大至少 10 倍,一头猪脾肿大 5~7 倍;肺出血、质硬,有间质性武汉配资网变化;下颌淋巴结、肠系膜淋巴结出血,切面呈大理石样变;胃浆膜面弥漫性出血;肾肿胀明显、色淡,未见出血点;扁桃体见陈旧性出血,符合 ASF 症状。国家外来动物疫病研究中心立即开展病原学检测,证实本次疫情由ASFV引起。这是我国历史上的首次 ASF 发病记录。

图1  发病场地位置

1 材料与方法

1.1 病料 

病原学样品:分别来源于 2 头病死猪的剖检病料,包括全血、脾脏、淋巴结、扁桃体;30 头临床健康猪的全血。血清样品:2 头病死猪及同群 30 头临床健康猪血清。 

1.2 病料 DNA 提取

在加有陶珠的组织匀浆管(Roche)中,加入600 L PBS 缓冲液,再加入剪碎的组织样品约 30 mg,使用 HyBaid RiboLyser 组织匀浆机进行匀浆处理。取 200 L 组织匀浆液和全血,分别使用场外配资 DNA 提取试剂盒提取 DNA。最后将提取的核酸于 80 ℃冰箱中保存备用。

1.3 荧光定量 PCR

依据文献报道,用本实验室建立的 OIE 推荐的 ASFV 特异的荧光定量 PCR 方法进行 ASFV p72 基因片段的扩增。ASFV 特异性引物为 king-s/king-a,TaqMan 探针为 ASFVP,同时以本试验室合成的质粒 DNA 标准品为阳性对照。

1.4 普通 PCR

依据文献报道,用本实验室建立的 OIE 推荐的 ASFV 特异的 PCR 方法进行 ASFV p72 基因片段的扩增。ASFV 特异性引物为 PPA1/PPA2,产物长度为 257 bp,同时以本试验室合成的质粒DNA 标准品为阳性对照。

1.5 测序片段 PCR 扩增

依据文献报道,合成扩增 p72 基因分型的通用型引物(p72-D/p72-U)。引物由上海生工生物技术有限公司合成。采用高保真的 Phusion High-Fidelity PCR Master Mix 扩增 B646L/p72 基因片段,预期扩增片段大小 478 bp。50 μL 的 PCR 反应体系 为:2X Phusion Master Mix 25 L,p72-D(10 μmol/L) 和 p72-U(10 μmol/L) 各 2 L, 模板DNA 2 μL,用灭菌水补齐体积至 50 μL。PCR 反应程序为:98 ℃预变性 30 s;然后进行 35 个 PCR 循环(98 ℃ 10 s,52 ℃ 30 s,72 ℃ 30 s);最后 72 ℃ 10 min。

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